肉毒堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶（CPT-1）試劑盒說(shuō)明書(shū)

分光光度法 50 管/48 樣

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定測(cè)定意義：

肉毒堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶是存在于線粒體內(nèi)膜的一類酰基轉(zhuǎn)移酶。可逆地催化從酰基fu酶 A 將酰基轉(zhuǎn)移至L-肉毒堿的反應(yīng)，在轉(zhuǎn)運(yùn)脂肪酸通過(guò)線粒體內(nèi)膜的過(guò)程中起重要作用。

測(cè)定原理：

基于肉堿和脂酰fu酶A 在丙二酰fu酶A 存在與否的條件下，通過(guò)肉堿脂酰轉(zhuǎn)移酶(CPT-I)的作用，產(chǎn)生脂酰肉堿，并釋放出巰基fu酶A(COA-SH)，與Ellman 試劑DN-TB 反應(yīng)后，產(chǎn)生黃色的 TNB。通過(guò)其吸收峰值得變化（412nm），來(lái)定量分析CPT-1 的活性。

肉毒堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶試劑盒 脂肪酸系列

組成：

自備儀器和用品：

可見(jiàn)分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1ml 玻璃比色皿、研缽、冰、無(wú)水乙醇和蒸餾水

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)的參數(shù)為準(zhǔn)

樣本的前處理：

組織、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：

稱取約 0.1g 組織或收集 500 萬(wàn)細(xì)胞，加入 1ml 試劑一和 10uL 試劑三，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。將勻漿液于 600g，4℃離心 5min。

棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，11000g，4℃離心 10min。

上清液即胞漿提取物，可用于測(cè)定從線粒體泄漏的 CPT-1（此步可選做）。

在步驟④的沉淀中加入 200uL 試劑二和 2uL 試劑三，超聲波破碎（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3 秒，間隔 10 秒，重復(fù) 30 次），用于線粒體 CPT-1 測(cè)定。

測(cè)定步驟：

1、分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 412nm，蒸餾水調(diào)零。

2、樣本測(cè)定

（1） 在試劑五中加入 2ml 無(wú)水乙醇，混勻，再加入 44ml 試劑四，混勻，37℃（哺乳動(dòng)物）或 25℃（其它物種）孵育 5min；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融；

（2） 在試劑六中加入 2ml 蒸餾水，混勻，37℃（哺乳動(dòng)物）或 25℃（其它物種）孵育 5min；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融；

（3） 在 1ml 玻璃比色皿中加入 40μl 樣本、880μl 試劑五和 40μl 試劑六，混勻，記錄 412nm 處 20 秒時(shí)的初始吸光度A1 和 2 分 20 秒時(shí)的吸光度 A2，計(jì)算ΔA=A2-A1。

CPT-1 活性計(jì)算：

（1） 按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每mg 組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1 nmol TNB 定義為一個(gè)酶活力單位。 CPT-1（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V 樣×Cpr) ÷T=880×ΔA÷Cpr此法需要自行測(cè)定樣本蛋白質(zhì)濃度。

（2） 按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每g 組織每分鐘催化產(chǎn)生 1 nmol TNB 定義為一個(gè)酶活力單位。

CPT-1（nmol/min/g 鮮重）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷（W× V 樣÷V 樣總）÷T=177.8×ΔA÷W

（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每 1 萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生 1 nmol TNB 定義為一個(gè)酶活力單位。

CPT-1（nmol/min/10⁴ cell）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷（500×V 樣÷V 樣總）÷T=0.3556×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積，9.6×10^-4 L；ε：TNB 摩爾消光系數(shù)，1.36×10⁴ L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm； V 樣：加入樣本體積，0.04 ml；V 樣總：加入提取液體積，0.202 ml；T：反應(yīng)時(shí)間，2 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500 萬(wàn)。

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