EndoFree Plus Plasmid Maxi Kit

無內毒素質粒大提試劑盒(增強型)

無內毒素質粒大提試劑盒（增強型）核酸提取

目錄號：31113-10

產品內容：

保存條件：

在室溫(15 ~ 25℃)干燥條件下，可保存 12 個月。

RNase  A、內毒素清除劑，可常溫運輸，-20℃保存。

具體產品的參數以收到產品說明書的參數為準

產品簡介：

無內毒素質粒大量提取試劑盒可提取 100-300ml 菌液，采用改進的 SDS-堿裂解法裂解細胞，通過du特的內毒素清除劑選擇性結合離心除去內毒素，然后離心吸附柱內的硅基質膜在高鹽、低 pH 值狀態下選擇性地結合溶液中的質粒 DNA，再通過去蛋白液和漂洗液將雜質和其它細菌成分去除，最后低鹽、高 pH 值的洗脫緩沖液將純凈質粒 DNA 從硅基質膜上洗脫。所得質粒可直接用于mei切、轉化、PCR、RT-qPCR、測序及轉染等分子生物學實驗。

產品特點：

1.     du特工藝配方清除內毒素，內毒素含量極低（< 0.1 EU/ug DNA），細胞轉染效果ji佳。

2.        得率高： 150 – 300 ml 菌液可提出多達 500– 2000 ug 的純凈質粒。

重要提示：

一、使用前請先檢查平衡液、溶液 P2 和溶液 N3 是否出現渾濁，如有混濁現象，可在 37℃

水浴中加熱幾分鐘，即可恢復澄清，不要劇烈搖晃，以免形成過量的泡沫。

二、第一次使用前請先在去蛋白液 PE、漂洗液 WB 中加入zhi定量無水乙chun（見瓶身標簽），充分混勻，并做好標記，以免多次加入。

三、首ci使用時請先將 RNase A 全部加到溶液 P1 中，混勻，每次使用后置于 2 ~ 8℃保存。

操作步驟：

1.   取 150 ~ 200 ml（最多 300ml）過夜培養的菌液，室溫 9,000 rpm 離心 1 min，盡量倒干上清，收集菌體。

（注意： 如果用 50ml 離心管收集菌體，離心棄上清后，在同一管內加入更多的菌液，重復步驟 1）

2.  加入 7.5 ml 溶液 P1，重懸菌體沉淀，渦旋震蕩至che底懸浮。

（注意：如有未che底懸浮的菌塊會影響裂解，導致提取的質粒濃度及純度降低）

3.  加入 7.5 ml 溶液 P2，溫和地上下翻轉 6-8 次，使菌體充分裂解，室溫放置 4 min。

（注意：不可劇烈震蕩，以免造成基因組 DNA 片段的污染，所用時間不要超過 5 min，以免質粒受到破壞，如未wan全變得清亮，可能是菌體太多，可增加溶液 P2 的用量，在后續的操作中溶液 P3 的用量也要相應增加）

4.  加入 7.5 ml 溶液N3，立即溫和地上下翻轉 6-8 次，充分混勻時會出現白色絮狀沉淀，

然后室溫 9,000 rpm 離心 10 min,小心取上清至新管。

（注意：加入溶液 N3 后應立即混合，避免產生 SDS 的局部沉淀）

5.  加入 0.1 體積(上清的體積的 10%，約 2.4 ml)的內毒素清除劑到上一步所得上清，顛倒

旋轉混勻。冰浴(或冰箱冷凍室)放置 5 分鐘，直到渾濁變清亮透明（或仍舊稍有渾濁），中間偶爾混勻幾次。

（注意：內毒素清除劑加入上清后，上清會變得渾濁，但是冰浴后應恢復清亮,或稍渾濁。）

6. 常溫放置 3 ~ 5 分鐘，溶液很快變為渾濁，顛倒混勻。（37℃水浴可加速渾濁）

7. 室溫 9,000 rpm 離心 10 min 分相。上層水相含 DNA，下層藍色油狀相含內毒素和其它雜質。將含 DNA 的上層水相（上清）轉移到新管，棄油狀層。

8.加入 0.5 倍上清體積的異丙chun（約 11 ml）,充分顛倒混勻，分兩次（每次不超過 10 ml）轉入吸附柱中（吸附柱放入收集管中），9,000 rpm 離心 1min，質粒被吸附在膜上，倒棄收集管中的濾液，直到所有混合溶液通過此吸附柱。

9.可選步驟：向吸附柱中加入 10 ml 去蛋白液 PE，室溫 9,000 rpm 離心 1 min，棄濾液。

（注意：去蛋白液 PE 為濃縮液，按要求加入無水乙chun，用后應立即蓋緊瓶蓋，以防酒精揮發）

（注意：如果宿主菌是 endA-，如 DH5α，此步驟可省略。如果宿主菌是 endA+，如 TG1、BL21、 HB101、JM101 等，此步驟不可省略，因這些宿主菌含有大量的核酸mei，易降解質粒。如果提取低拷貝質粒也推薦采用此步驟）

10.      加入 10 ml 漂洗液 WB，室溫 9,000 rpm 離心 1 min，棄濾液。

（注意：漂洗液 WB 為濃縮液，按要求加入無水乙chun，用后應立即蓋緊瓶蓋，以防酒精揮發）

11.      重復步驟 10 一次。

12.     將吸附柱放進收集管，室溫 9,000 rpm 離心 3 min，甩干膜上殘留乙chun。

13.     將吸附柱置于一個新的 50 ml 離心管（自備）中，加入 1 ~ 2 ml 的洗脫緩沖液EB，室溫放置 2 min，9,000 rpm 離心 2 min，離心管底溶液即質粒 DNA。

（注意：事先在 65~70℃水浴中預熱洗脫緩沖液 EB，可增加洗脫效率；

如果需要較多量質粒，可將得到的溶液重新加入吸附柱中，再次離心 1 min 收集；如需使用去離子水洗脫，可用 NaOH 調整其 pH 值在 7.0 - 8.5 之間。）

無內毒素質粒大提試劑盒（增強型）核酸提取